Поняття про біотестування і тест-об’єкти

0 5

Біотестування (bioassay) – це процедура встановлення токсичності середовища за допомогою тест-об’єктів, що сигналізують про небезпеку незалежно від того, які речовини і в якому поєднанні викликають зміни життєво важливих функцій у тест-об’єктів.

Тест-об’єкт (test organism) – організм, який використовується при оцінці токсичності середовища (хімічних речовин, природних і стічних вод, грунтів, донних відкладень, кормів та ін.)

Т ест-функція (test function) – це ж ізненная функція або критерій токсичності (toxicity criterion), які використовуються для характеристики відгуку тест-об’єкта на шкідливу дію середовища.

Тест функції для різних організмів

• для інфузорій, ракоподібних, ембріональних стадій молюсків, риб, комах – виживаність (смертність) тест-організмів.

• для ракоподібних, риб, молюсків – плодючість, поява аномальних відхилень у ранньому ембріональному розвитку організму, ступінь синхронності дроблення яйцеклітин.

• для культур одноклітинних водоростей і інфузорій – загибель клітин, зміна (приріст або спад) чисельності клітин в культурі, коефіцієнт ділення клітин, середня швидкість росту, добовий приріст культури.

• для рослин – енергія проростання насіння, довжина первинного кореня і ін.

види биотестов

Гострі біотести (acute tests) за показниками виживаності, тривають від декількох хвилин до 24-96 год.

Короткострокові (short-term chronic tests) хронічні тести тривають протягом 7 діб і закінчуються, як правило, після отримання першого покоління тест-об’єктів.

Хронічні тести (chronic tests) на загальну плодючість ракоподібних, що охоплюють 3 покоління.

Алгоритм виконання біотестування

Відбір проби середовища (вода, донні відкладення, грунт). Проби не підлягають консервації хімічними речовинами або заморожування

Підготовка досліджуваних проб (приготування водних витяжок донних відкладень, внесення в пробу необхідних хімічних речовин, підготовка проб грунтів і т.д.)

Підготовка проб порівняння (незабруднене середа)

Внесення тест-об’єкта в досліджувану пробу і пробу порівняння

Витримка проб в певних умовах певний час

Визначення відгуку тест-об’єктів на дію середовища. Проводиться візуально або за допомогою приладів

Вступ

В даний час одним з найбільш широко застосовуваних методів контролю токсичності забруднення навколишнього середовища є біотестування. Цей метод заснований на контролі у лабораторно-отриманого біооб’єкту найбільш чутливого до певних класів забруднювачів – тест-об’єкта аппаратурно реєструється або кількісно вимірюваної реакції – тест-реакції.

В даний час, є значний досвід застосування найрізноманітніших біологічних об’єктів для визначення ступеня забруднення навколишнього середовища. Мікроорганізми найбільш зручні в якості тест-об’єкта на увазі можливості їх культивування в стандартних умовах і популяційної реакції, що забезпечує статистичну вірогідність дослідження токсикантів. При цьому тест-об’єкт повинен бути добре вивченим.

Останнім часом найбільш перспективними організмами для індикації вважаються мікроорганізми. Вони мають високу чутливість, високою швидкістю розмноження, простотою культивування і використовуються в приладах і системах, призначених для швидкої і точної оцінки стану навколишнього середовища.

Біотестування

Биотестирование – вид біологічного контролю об’єктів навколишнього середовища, заснований на вимірюванні тест-реакції тест-організму до шкідливого фактору, який передбачає проведення лабораторних експериментів з живим істотами. Тест-організм – спеціально вирощений в контрольованих умовах організм, найбільш чутливий для даного виду біологічного контролю. Тест-реакція – кількісно вимірюється зміна фізико-хімічних властивостей організмів (популяцій) при впливі шкідливого фактора.

Будь-який біологічний експеримент повинен проводитися при дотриманні наступних принципів:

  • 1. сталість умов;
  • 2. багаторазової повторюваності (при збереженні результатів);
  • 3. логічності;
  • 4. наявності опису, що дозволяє фахівцеві відтворити експеримент (при цьому його результат повинен зберігатися).

Ці принципи необхідно дотримуватися при лабораторних дослідах, натурних спостережень і проектуванні апаратури.

За тривалістю впливу шкідливих речовин на організми розрізняють: тести на виявлення токсичності гострої (тривалість менше 96 год) і хронічної (більше 96 год). В останніх тестах враховується ефект адаптації живих організмів до шкідливих факторів. При тестуванні якості біоцидних товарів часто застосовують тест-організми, що відносяться до різних типів біотичних елементів екосистеми.

В сучасних БІОТЕСТ простежується перехід від модельних організмів до модельних екосистемам, які за ступенем глобальності діляться на макрокосм (наприклад, відгороджені ділянки моря), мезокосму (як правило, ґрунтові співтовариства) і мікрокосму (декілька взаємопов’язаних видів організмів нижчих рівнів). Такий підхід дозволяє моделювати складні ситуації і будувати прогнози їх дозволу високою вірогідністю. З іншого боку, контроль стану модельних екосистем вимагає застосування комплексу технічних засобів, здатних оперативно відслідковувати динаміку показників стану, що представляє собою досить складну проблему.

Для зменшення впливу біологічної мінливості при проведенні біотестування, досліди проводять з великими групами генетично однакових організмів, вирощених в стандартних умовах. Це необхідно для виявлення статистично значущих відмінностей між реакціями на контрольну і дослідну середу.

Слід врахувати, що живі організми дуже чутливі до речовин, що містяться не тільки в воді, але і в повітрі. Навколишнє середовище лабораторії не повинна містити шкідливих речовин. Досліди повинні приводитися при певній температурі і вологості. Зокрема, слід звернути особливу увагу на:

  • · Летючі речовини прімишленного (пари кислот, сполуки важких металів, летючі вуглеводні), сільськогосподарського (антибіотики, пестициди, токсини цвілі), побутового та санітарно-гігієнічного (інсектициди, дезинфікуючі речовини) походження;
  • · Наявність ультрафіолетових ламп або випромінювання з ультрафіолетової складової спектра.

Биотестирование засноване на досягненнях біотехнології. Біотехнологією називається промислове використання біологічних процесів на основі отримання високоефективних форм мікроорганізмів. Культур клітин, тканин рослин і тварин із заданими властивостями.

Для біотестування необхідні організми, що реагують на низькі концентрації забруднювача і здатні зберігати хемочувствітельності при зміні (в необхідному діапазоні) інших факторів навколишнього середовища, наприклад температури і кислотності. Як правило, найбільш чутливо реагують на шкідливі речовини організми, що живуть в прісній і проточною водах.

Обрана тест-культура повинна відповідати наступним формам:

  • · Біологічна значущість – тест-об’єкт повинен бути типовим представником природної екосистеми;
  • · Абсолютна нешкідливість використовуваного мікроорганізму;
  • · Гарна вивченість біохімії, фізіології мікроорганізму;
  • · Висока чутливість до досліджуваної групи речовин;
  • · Доступність культивування для будь-якої практичної лабораторії;
  • · Низька вартість отримання.

Слід враховувати, що багато зовні схожі мікроорганізми можуть володіти різною чутливістю до шкідливих речовин і вимагати різних умов утримання. Тому вид потрібно правильно визначити за характерними ознаками (ідентифікувати), визначення може бути візуальним або за допомогою апаратурних засобів.

Для вирощування будь-якого організму необхідно дотримуватися таких правил:

  • 1. регулярно проводити підгодівлю.
  • 2. видаляти продукти життєдіяльність.

Так як згідно В.І. Вернадського, організми не можуть розвиватися в середовищі своїх відходів.

біотестування токсичність популяція

Вид організму, для якого відомі методи ідентифікації. Методики вирощування і біофізичні властивості, називається штамом.

Вирощування тест-об’єктів включає наступні стадії:

  • · Відбір штаму генетично чистого виду;
  • · Розмноження при дозованому стандартному годуванні;
  • · Очищення від побічних продуктів.

Бактерії є зручним тест-об’єктом з наступних причин:

  • · Численність популяції бактерій (від 10 в 9 ступені клітин в 1 мл) підвищує статистичну достовірність отриманих результатів;
  • · Бактерії є елементом будь-якої екосистеми;
  • · На популяції бактерій можна простежити вплив шкідливого чинника на декількох поколіннях за дуже короткий термін;
  • · Завдяки невеликим розмірам клітин (одиниці мікрометрів) мікробна популяція має велику поверхню контакту з навколишнім середовищем.

Генетична інформація бактерій полягає в капсулах з ДНК і розсіяна по всій цитоплазмі. Тому їх відносять до прокариотам. Харчування і вирощування продуктів обміну у бактерій відбувається через напівпроникну оболонку клітини.

Бактерії вирощують на поживних бульйонах, містять повний набір мікроелементів і амінокислот. До найбільш поширеною живильної бактеріальної середовищі відноситься ГРМ-бульйон. Вироблений з гідролізату рибного борошна.

Бактерії вирощують для отримання ферментів, фармацевтичних препаратів, добавок в молочні біопрдукти.

Бактерії мають високу швидкість розмноження – популяція при сприятливих умовах подвоюється кожні 30 хв. Тому велике значення при їх вирощуванні має стерильність вирощування, при якій не допускається попадання в живильне середовище інших видів бактерій.

Бактерії – тип мікроскопічних, в більшості одноклітинних, організмів, що володіють клітинною стінкою. У бактерій є примітивна ядро, позбавлене помітних хромосом і оболонки. Є бактерії, що містять зелений пігмент-хлорофіл. Більшість бактерій мають паличкоподібну або круглу форму. Вперше бактерії побачив голландський натураліст А. Левенгук (1683) через свій мікроскоп.

Одні і ті ж види бактерій можна знайти майже повсюдно, на всіх матом. В 1 г грунту містяться сотні тисяч або мільйони бактерій, в 1 мл води-десятки або сотні.

Бактерії активно беруть участь у кругообігу речовин в природі.

Серед цих організмів чимало хвороботворних, що викликають хвороби у людини, тварин і рослин.

До складу клітин бактерій входять ті ж елементи і мікроелементи, що і до складу клітин вищих рослин і тварин. Для життєдіяльності бактерій потрібні азот, мінеральні солі, вуглець, вітаміни. Деякі бактерії здатні засвоювати азот з атмосфери. До таких азотфиксирующим мікроорганізмам відносяться азотобактер, бульбочкові бактерії, які використовуються для виготовлення бактеріальних добрив.

Деякі з бактерій використовуються в харчовій промисловості (наприклад, для приготування молочнокислих продуктів), в медицині для відновлення нормальної мікрофлори товстої кишки шляхом застосування препаратів, що містять лиофильно висушені бактеріальні клітини і бактеріальні спори (біфідобактерії, лактобактерії, кишкові палички), а також в біотехнології для отримання біологічно активних сполук. Найбільшого поширення мають сапрофітні бактерії. Вони харчуються мертвими органічними залишками, беруть участь в мінералізації органічних речовин – аммонификации, нітрифікації, а також в фіксації азоту (клостридії, Азотобактери, мікобактерії, синьо-зелені водорості та ін.). Сапрофіти беруть участь у кругообігу вуглецю, кисню, азоту, фосфору, сірки, заліза, деякі з них розщеплюють целюлозу, кератин, окислюють і утворюють вуглеводні – метан, пропан і ін. Ставиться питання про застосування деяких сапрофітів для очищення стічних вод, руйнування (біодеградації) різних відходів. Широке застосування знаходять сапрофіти в біотехнології для отримання різних біологічно активних сполук (інтерферонів, інтерлейкінів, інсуліну та ін.). Відносно невелику частину бактерій поділяють на патогенні і умовно-патогенні. Патогенні бактерії є збудникамиінфекційних хвороб людини і тварин. Умовно-патогенними мікроорганізмами є представники нормальної мікрофлори людини . При ослабленні резистентності організму умовно-патогенні бактерії викликають гнійно-запальні процеси.

Часто в якості тест-об’єкта використовують інфузорії Paramecium caudatum.

Інфузорії Paramecium caudatum представляють царство тварин, але мають мікроскопічними розмірами і побудовані у вигляді однієї клітини. Незважаючи на простоту організації, поєднують в собі ознаки окремої клітини і цілісного організму. Інфузорії за своїми біохімічними параметрами дуже близькі до вищим тваринам і людині, що робить можливою екстраполяцію даних, отриманих в біотестування c інфузоріями на людину. Вони в багатьох випадках виявляються значно чутливіші, ніж традиційно використовувані лабораторні тварини.

Туфелька – мешканець стоячих водойм з великою кількістю розкладається органічного матеріалу.

Paramecium caudatum має постійну подовжену форму з тупим переднім і загостреним заднім кінцями. Розміри інфузорії – 200х40 мкм. Вся клітка покрита тонкою і гнучкою комірчастої пеллікулой. Вії покривають всю поверхню туфельки, розташовуючись поздовжніми діагональними рядами. Оптимальна температура для даної інфузорії 30 – 32 ° C. Краще значення pH середовища 6.3-7.5.

Розмножуються інфузорії 2-3 рази на добу.

Переваги Paramecium caudatum як тест-об’єкта наступне: невибаглива в культивуванні; поєднує в собі як риси сильно ускладненою клітини, так і особливості самостійного організму зі складними формами поведінки, по чутливості до ядер не поступається, а часто і перевершує інші тест-об’єкти.

Інфузорії вирощуються в нестерильних умовах при кімнатній температурі в посуді з хімічного скла, наприклад в скляних колбах, склянках, чашках Петрі та інших.

Як корм використовують бактерії, дріжджі і їх суміш, вирощені стерильно на твердих середовищах. При відсутності умов для вирощування стерильного корми, можна використовувати воздушносухого пекарські дріжджі.

До загальних положень по вирощуванню культури відноситься обов’язкова вимога ідентичності середовища вирощування і середовища, яка буде використана для процедур відмивання культури від продуктів метаболізму, отримання робочої суспензії, розведення водних проб і інших процедур з культурою. Мікроорганізми культивуються на середовищі Лозина-Лозинського, для приготування якої використовуються дистильована вода, набір солей: NaCl, KCl, CaCl2, MgSO4, NaHCO3.

Культуру відмивають від продуктів метаболізму і старого корму, додають сухі дріжджі в кількості 50 мг на 50 мл і поміщають в чашку Петрі. Для підтримки культури відмивання і годування здійснюється 1 раз в тиждень. При відмиванні використовують нормальну фізіологічну реакцію інфузорій збиратися в верхніх шарах рідини. Використання судин з вузьким довгим горлом дозволяє сконцентрувати інфузорії в верхній частині та злити їх в іншу посудину з мінімальною кількістю забрудненої культурального середовища. Концентрат розбавляють чистою середовищем Лозина -Лозінского до обсягу 50 мл.

Визначення концентрації суспензії інфузорій Концентрацію клітин необхідно контролювати в процесі вирощування культури, при підготовці робочої суспензії клітин і для визначення величини тест-реакції.

Вихідну суспензію інфузорій збовтати, відібрати за допомогою піпетки 1.0см3 суспензії. До цього обсягу додати 9,0см3 1% -ного розчину NaCl.Такім шляхом досягається знерухомлення інфузорій. Не чекаючи повного знерухомлення інфузорій (приблизно через 2-5 хв) з розбавленою суспензії відбирають 0,5-1,0см3 і розподіляють цей обсяг у вигляді 6-10 великих крапель на сухому склі (наприклад, в чашці Петрі) .За допомогою мікроскопа ( лупи) підраховують інфузорії у всіх краплях. Отриманий результат перераховують на 1см3 вихідної суспензії.

Вам также могут понравиться

Оставьте ответ

Ваш электронный адрес не будет опубликован.

Enable referrer and click cookie to search for pro webber